Protocoles d'analyses du sperme et des interactions spermatozoïdes - glaire cervicale

Détermination du fructose: méthode UV

Kit Boehringer D-Glucose/D-Fructose n°réf:139 106

Principe

Le fructose est une substance sécrétée par les vésicules séminales. Il est stocké sous la forme de D-fructose.

Le D-Glucose et le D-Fructose sont phosphorilés par l'enzyme hexokinase (HK) et l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) (1), (2) en glucose-6-phosphate (G-6-P) et fructose-6-phosphate (F-6-P) avec la formation simultanée en adénosine-5'-diphosphate (ADP).

1) D-Glucose + ATP G-6-P + ADP

2) D-Fructose + ATP F-6-P + ADP

En présence de cet enzyme glucose-6-phosphate déhydrogénase (G6P-DH), le G-6-P est oxydé par la nicotinamide-adénine dinucléotide phosphate (NADP) avec la formation réduite du nicotinamide-adénine dinucléotide phosphate (NADPH) (3).

3) G-6-P + NADP gluconate-6-phosphate + NADPH + H

L'élévation du NADPH, est formé par réaction stoichiométrique avec l'élévation du glucose. C'est le NADPH qui est mesuré par son absorbance moyenne à 334, 340 ou 365nm.

En complément de la réaction (3), F-6-P est converti en G-6-P par le phosphoglucose isomérase (PGI) (4).

4) F-6-P G-6-P

Le G-6-P réagit avec le NADP pour former du gluconate-6-phosphate et du NADPH. L'élévation du NADPH est obtenu par réaction stoichiométrique avec l'élévation du fructose. L'augmentation du NADPH est mesurée par son absorbance moyenne.

Contenu du test (kit)

1. La bouteille n°1 contient approximativement 5g de poudre mélangée, constituée de tampon triethanolamine, pH 7.6; 64mg de NADP; 160mg d'ATP; sulphate de magnésium; stabilisateurs.
2. La bouteille n°2 contient 0.7ml de suspension enzymatique, constituée d'hexokinase, approximativement 200 U; du glucose-6 phosphate déhydrogénase, approximativement 100 U.
3. La bouteille n°3 contient 0.7ml de phosphoglucose isomerase, approximativement 490 U.
4. (Solution standard de D-glucose) Pas utilisé par le laboratoire, voir Standards:

Standards

Solution stock de D-Fructose: (160mg/20ml)

• 8mg/ml + dil.1/2 = 4mg/ml
• 4mg: 1vol. stock
• 3mg: 3vol. stock + 1vol. NaCl
• 2mg: 2vol. stock + 2vol. NaCl
• 1mg: 1vol. stock + 3vol. NaCl

Prétraiter les standards comme les échantillons.

Préparation des solutions

• Solution n°3: 150µl de suspension enzymatique. (Se garde 1 année à 4°C). 450µl de NaCl 0.9%
• Solution n°2: Utiliser tel quel. (Se garde 1 année à 4°C)
• Solution n°1: Diluer dans 27ml d'H2O distillée. (Se garde 4 semaines à 4°C)

	BLANCS	STANDARDS	ANALYSES
Solution n°1	200µl	200µl	200µl
H2O distillée	400µl	400µl	400µl
NaCl 0.9%	50µl	---	---
Standards	---	50µl	---
Analyses	---	---	50µl
Solution n°2	20µl	20µl	20µl
Incuber à 25°C pendant 20min. Lire la 1ère extinction à 366 nm.
Solution n°3	20µl	20µl	20µl
Chaque 30sec ajouter solution n°3. Incuber 20min. Lire la 2ème extinction à 366 nm.

CALCULS: E2 - E1 = E

Lire l'extinction sur la courbe d'étalonnage, pour déterminer la concentration.

NB: Ne pas oublier d'inscrire les résultats sur le cahier réservé au fructose.

Résultats

-Courbe standard: Faire un graphique de la Densité Optique (ordonnée), en fonction de la concentration en fructose (abscisse).

-Inconnues(sperme): Lire les concentrations en fructose sur la courbe standard.

Valeurs normales: 25-104µmol/éjaculat.